熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET)
熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過程。此過程沒有光子的參與，所以是非輻射的。該分析方法具有快速、敏感和簡單等優(yōu)點(diǎn)。
用于FRET試驗(yàn)的染料是可以相同的。但在大多數(shù)應(yīng)用中其實(shí)是使用不同的染料。簡單地說，熒光共振能量轉(zhuǎn)移是在供體基團(tuán)的激發(fā)狀態(tài)下由一對偶極子介導(dǎo)的能量從供體(染料1)向受體(染料2)轉(zhuǎn)移的過程。通常，供體 （Donor）熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜要與受體（Acceptor）基團(tuán)的吸收光譜有一定的重疊。當(dāng)這兩個熒光基團(tuán)間的距離合適時(shí)（10 – 100 ?)），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。能量轉(zhuǎn)移發(fā)生方式依賴于受體的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
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a) 被轉(zhuǎn)化為分子的振動，即發(fā)生能量轉(zhuǎn)移熒光熄滅。(受體是猝光劑)
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b) 發(fā)射更強(qiáng)于受體本身的特征熒光，造成次級熒光光譜的紅移。 (受體是熒光發(fā)射體)。
一個供體基團(tuán)（EDANS）和接受基因（DABCYL）勻被連接到一HIV蛋白酶的天然底物上，當(dāng)該底物未被切斷時(shí)，DABCYL可淬滅EDANS，從而檢測不到熒光。當(dāng)該底物被HIV-1蛋白酶切斷后，EDANS不再被DABCYL淬滅，隨即可檢測到EDANS熒光。蛋白酶抑制劑的有效性可憑借EDANS熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行監(jiān)測。
FRET肽是研究肽酶特異性的便利工具，由于其反應(yīng)過程可被連續(xù)監(jiān)測，為酶活性的檢測提供了一個便捷的方法。供體/受體對的肽鍵水解后產(chǎn)生的熒光可衡量納摩爾級濃度的酶活性。當(dāng)FRET肽是完整的，表現(xiàn)出的是內(nèi)部的熒光猝滅，但當(dāng)供體/受體對的任何肽鍵斷裂就會釋放出熒光，此熒光可被連續(xù)檢測，從而可對酶的活性進(jìn)行定量分析。
FRET 肽可作為各類酶研究的合適底物，比如：
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肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的動力特征和功能特征。
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對新的蛋白水解酶的篩選和檢測。
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對多肽折疊的構(gòu)象研究。
以下是一些用于FRET的標(biāo)準(zhǔn)染料組合::
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Fluorescein and Dabcyl:FAM/Lys(Dabcyl)
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Fluorescein and Tamra: FAM/TAMRA
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Methoxy-coumarin-acetic-acid(MCA) and 2,4-Dinitrophenyl(DNP): MCA/Lys(Dnp).
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Ortho-aminobenzoic acid (Abz) and 2,4-dinitrophenyl (Dnp) or N-(2,4-dinitrophenyl)ethylenediamine (EDDnp): Abz/Tyr (NO2), Abz/EDDnp
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Dabcyl and Glu(EDANS)
在蛋白酶的多肽底物內(nèi)經(jīng)共振能量轉(zhuǎn)移引發(fā)熒光猝滅的供體-接受對
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波長(nm)
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猝滅劑
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熒光團(tuán)
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激發(fā)波
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發(fā)射波
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Dabcyl
Dansyl
DNP
DNP
DNP
Tyr (NO2)
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Edans
Trp
Trp
MCA
Abz
Abz
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336
336
328
328
328
320
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490
350
350
393
420
420
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常規(guī)RET供體-接受對的福斯特臨界距離（Forster Critical Distance）
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Donor
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Aceptor
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Forster Distance
(Nanometers)
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Tryptophan
IAEDANS (1)
BFP
Dansyl
Dansyl
CFP
CF (3)
Fluorescein
Cy3
GFP
BODIPY FL (4)
Rhodamine 6G
FITC
B-Phycoerythrin
Cy5
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Dansyl
DDPM (2)
DsRFP
FITC
Octadecylrhodamine
GFP
Texas Red
Tetramethylrhodamine
Cy5
YFP
BODIPY FL (4)
Malachite Green
Eosin Thiosemicarbazide
Cy5
Cy5.5
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2.1
2.5-2.9
3.1-3.3
3.3-4.1
4.3
4.7-4.9
5.1
4.9-5.5
>5.0
5.5-5.7
5.7
6.1
6.1-6.4
7.2
>8.0
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(1): 5-(2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid
(2): N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl) maleimide
(3): carboxyfluorescein succinimidyl ester
(4): 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene