熒光修飾可以通過共價(jià)鍵的形式連接在多肽序列的N端或C端，但是更推薦在N端進(jìn)行修飾。 以下為合生生物常用熒光

修飾以及發(fā)光顏色。

熒光標(biāo)記肽結(jié)合成像技術(shù)后可用于識(shí)別特定靶點(diǎn)。共聚焦或熒光顯微鏡的體外成像仍然是研究細(xì)胞內(nèi)各種生物過程和相

互作用十分有效的方法之一。與蛋白質(zhì)不同，這些肽定位于肌動(dòng)蛋白上的特定靶點(diǎn)，不易聚集蛋白質(zhì)，因此非常適合于

體外跟蹤。同樣，FITC標(biāo)記的CPP也可被用于細(xì)胞內(nèi)組分的成像，且其細(xì)胞毒性低。

其中，FITC 是一種胺活性的熒光染料，可廣泛的用于標(biāo)記多肽和蛋白質(zhì)。合生生物在N端標(biāo)記Fitc，都會(huì)建議在后面一

個(gè)氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應(yīng)產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入烷基間隔器（alkyl spacer）如氨基己酸（Ahx）。鏈接切割

需要酸性環(huán)境，在N端標(biāo)記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會(huì)伴有后面一個(gè)氨基酸的去除，但當(dāng)有一個(gè)

間隔器如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的肽從樹脂上切下來時(shí)，這種情況可避免?？臻g位阻被認(rèn)為是在熒光染

料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。

下圖是合生生物經(jīng)典案例之一：

合成FITC-Ahx-RAKWNNTLKQIASK的MS&HPLC圖譜

對于較長的序列，建議使用 FRET pairs (fluorescence resonance energy transfer pairs)進(jìn)行修飾。 

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是描述兩個(gè)熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移的機(jī)制。由于FRET效率部分基于供體和受體分子之間的

距離，因此該技術(shù)通常用于研究酶效率，蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用或其他分子動(dòng)力學(xué)。

圖1.蛋白酶研究的FRET機(jī)制。

(當(dāng)肽保持完整時(shí)，受體分子將淬滅供體分子，并且不會(huì)檢測到熒光。如果序列被蛋白酶活性切割，則受體將不再淬滅

供體，并且將檢測到熒光信號)

FRET肽是研究肽酶特異性的便利工具，由于其反應(yīng)過程可被連續(xù)監(jiān)測，為酶活性的檢測提供了一個(gè)便捷的方法。

供體/受體對的肽鍵水解后產(chǎn)生的熒光可衡量納摩爾級濃度的酶活性。當(dāng)FRET肽是完整的，表現(xiàn)出的是內(nèi)部的熒光猝

滅，但當(dāng)供體/受體對的任何肽鍵斷裂就會(huì)釋放出熒光，此熒光可被連續(xù)檢測，從而可對酶的活性進(jìn)行定量分析。

FRET 肽可作為各類酶研究的合適底物，比如：

1. 肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的動(dòng)力特征和功能特征。

2. 對新的蛋白水解酶的篩選和檢測。

3. 對多肽折疊的構(gòu)象研究。

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