細(xì)胞介紹

HCT-15/FU為由HCT-15細(xì)胞構(gòu)建的耐5-FU藥物細(xì)胞株。

細(xì)胞特性

細(xì)胞運(yùn)輸、保存及注意事項(xiàng)

細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制

1）5-FU藥物的配制及保存

建議將5-FU藥物配制成20mg/mL的母液，即使用1mL 1M的NaOH溶液溶解20mg 5-FU藥物，使其完全溶解。（若所購買的5-FU藥物規(guī)格為10mg，則加入0.5mL 1M的NaOH溶液，待其完全溶解即為20mg/mL母液）

注意：可根據(jù)用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致藥物失效。溶解后的5-FU，4℃保存1周，-20℃保存1個(gè)月，-80℃保存6個(gè)月。

2）凍存液的配制

90%上等胎牛血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。（凍存液中不含藥物）

3）完全培養(yǎng)基的配制

細(xì)胞培養(yǎng)條件

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%~80%。

細(xì)胞處理

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，均勻鋪于含6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。**天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

注意：①細(xì)胞復(fù)蘇過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細(xì)胞生長至匯合度達(dá)80%左右時(shí)，方可添加10~16ug/mL 5-FU藥物；若細(xì)胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當(dāng)降低5-FU的濃度（**降低一半藥物濃度），或使用不含5-FU的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長狀態(tài)較好時(shí)，再更換為所需的5-FU濃度。

②建議復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩，避免凍存管處于溫差較大情況下發(fā)生爆炸，造成 人員傷害。

2）細(xì)胞傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）

①待細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

②棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1次，吸凈殘余的PBS。

③加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細(xì)胞細(xì)胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶至細(xì)胞全部脫落。迅速拿回操作臺(tái)，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化。 

④將細(xì)胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。

⑤向細(xì)胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕吹混勻。將細(xì)胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個(gè)新的培養(yǎng)瓶/皿中，添加6~8mL完全培養(yǎng)基。

注意：細(xì)胞傳代1~2次后仍能保持增殖，即可提高藥物濃度至20ug/mL繼續(xù)培養(yǎng)；若此過程中細(xì)胞停止增殖，且狀態(tài)較差，則需降低藥物濃度（**降低一半藥物濃度）或使用不含藥物的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞匯合度約80%，且生長狀態(tài)較好時(shí)，再更換為所需的5-FU藥物濃度。

3）細(xì)胞凍存

①細(xì)胞凍存時(shí)，步驟同2）細(xì)胞傳代的①~④，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加入配制好的細(xì)胞凍存液，重懸細(xì)胞，按照1×10^6 ~ 1×107個(gè)細(xì)胞/mL分配到一個(gè)凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

注意：細(xì)胞凍存過程中，不可添加藥物。

②將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。