一、固相合成多肽的聚合物載體及連接分子

1.聚合物載體 固相合成多肽需要有固相載體及連接固相與反應(yīng)物的連接分子,正確選擇載體和連接分子決定著固相合成法的成功。固相合成多肽用的載體多數(shù)采用聚苯乙烯及二乙烯基苯和苯乙烯共聚物等高聚物的衍生物,如2-Cl樹(shù)脂、AM樹(shù)脂、Wang樹(shù)脂和氨基樹(shù)脂等。載體樹(shù)脂的溶脹狀況對(duì)縮合試劑及羧基組分的自由擴(kuò)散，對(duì)肽鏈之間的聚集等與縮合反應(yīng)有關(guān)的因素有明顯影響。為了使載體有較好的溶脹性，且有較大的網(wǎng)絡(luò)空間足以容納不斷增長(zhǎng)的較長(zhǎng)的肽鏈，而且便于反應(yīng)物進(jìn)入載體的內(nèi)部，一般均采用1%～2%交聯(lián)度的聚苯乙烯珠狀樹(shù)脂或微孔樹(shù)脂。

2.連接分子 固相合成多肽曾經(jīng)使用過(guò)鍵合不同連接分子的聚合物，這些連接分子為含有氯甲基、巰甲基、酰氯基、對(duì)苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二酰基、鄰硝基芐醇基及二苯氯硅烷等的雙官能團(tuán)化合物。一個(gè)理想的連接分子必須在整個(gè)合成過(guò)程中十分穩(wěn)定，并在合成后可以定量的切割下來(lái)而又不破壞合成的目標(biāo)分子。選擇適合的連接分子還應(yīng)根據(jù)與樹(shù)脂相連的肽的C末端的結(jié)構(gòu)類(lèi)型,裂解后生成相應(yīng)的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物。

二 、固相合成多肽的檢測(cè)

即使是高效的偶聯(lián)技術(shù)，也不能保證酰化反應(yīng)100%地進(jìn)行。而且當(dāng)遇到立體障礙或Β2片層等序列時(shí)，偶聯(lián)反應(yīng)的效率更大大下降。聚合物載體上總是有缺序或截序的多肽鏈，在解脫時(shí)，它們也進(jìn)入到產(chǎn)物中，給分離帶來(lái)很大困難。因此固相合成肽時(shí),尤其是較長(zhǎng)的肽時(shí)，每一個(gè)氨基酸的縮合率應(yīng)該達(dá)到99.9%，否則得到的產(chǎn)物將非常不純。因此，監(jiān)測(cè)每一步反應(yīng)的進(jìn)行過(guò)程顯得格外重要。（杭州專(zhuān)肽生物有著20余年的固相合成經(jīng)驗(yàn)，通過(guò)固相合成技術(shù)可以滿(mǎn)足絕大多數(shù)客戶(hù)的需求）

1、定性顏色反應(yīng) 茚三酮顯色法(Kaiser法)是用茚三酮 顏色反應(yīng)快速測(cè)定樹(shù)脂上的氨基，從而判定?；磻?yīng)是否完全。用茚三酮法檢測(cè)聚苯乙烯樹(shù)脂氨基的靈敏度可達(dá)到 5μmol/g。這樣的靈敏度已可檢測(cè)出縮合反應(yīng)是否進(jìn)行了99%以上。茚三酮檢測(cè)時(shí)，由于末端氨基酸殘基及序列不同，出現(xiàn)的顏色強(qiáng)弱不同。天門(mén)冬氨酸(Asp)、天門(mén)冬酰胺(Asn)會(huì)產(chǎn)生很弱的藍(lán)色或淡棕色。生色試劑2,4,6-三硝基苯磺酸與樹(shù)脂上氨基反應(yīng)顯示橙紅色，靈敏度為5μmol/g樹(shù)脂。

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Kaiser試劑包括：

A，6%茚三酮的乙醇溶液

B，80%苯酚的乙醇溶液

C，2%0.001MKCN的吡啶溶液

配制中的吡啶需要經(jīng)過(guò)茚三酮處理后，重蒸后再使用。檢測(cè)過(guò)程，取少量樹(shù)脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹(shù)脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說(shuō)明連接完全。還有其它檢測(cè)游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬蘭法等。

2、定量自由氨基檢測(cè) 水楊醛法用于接肽后樹(shù)脂上殘余氨基的量以及去除保護(hù)基后總氨基量的測(cè)定，可以定量地檢測(cè)縮合反應(yīng)以及脫除保護(hù)基的反應(yīng)是否完全。如不完全即可及時(shí)反復(fù)處理。用2%水楊醛+6%吡啶的乙醇溶液同樹(shù)脂上的氨基反應(yīng)(60℃,30～35分鐘)，洗凈后，再用5%芐胺乙醇溶液將水楊醛置換下來(lái)(60℃,30分鐘)，加芐胺的乙醇溶液稀釋后,讀315nm的光吸收值,計(jì)算氨基的量(Ε=4.36× 103)。此法對(duì)于—NH2在0.15μmol/mg樹(shù)脂以上的樣品的相對(duì)偏差在5%以?xún)?nèi)。

3、HPLC檢測(cè)部分保護(hù)的中間肽 在多肽合成中間，取少量的肽樹(shù)脂(3～10mg)進(jìn)行裂解，乙醚沉淀，溶于適當(dāng)溶劑中直接進(jìn)行HPLC分析。裂解時(shí)肽的N-端保護(hù)基根據(jù)需要保留或脫除。當(dāng)合成的肽是較短的極性肽時(shí)，可以保留保護(hù)基團(tuán)，否則在HPLC中保留時(shí)間太短，不利于分析。這個(gè)方法雖然比較麻煩，但所需時(shí)間較短，**度較高。

三 、反應(yīng)溶劑

二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)是肽固相合成中常用的溶劑，尤其是DMF對(duì)作用物和產(chǎn)物均具有溶解度高的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于多種反應(yīng)系統(tǒng)中。雖然DMF有更好的溶解度，但沸點(diǎn)較高，需要減壓才能蒸去。而且副產(chǎn)物N-?；逶诟呓殡姵?shù)的溶劑〔DMF，甲氰 (CH2CN)，二甲亞砜(DMSO)，H2O等〕中容易生成，而在低介電常數(shù)的溶劑(CH2Cl2、CCl4、C6H6等)中比較不容易生成。在非極性溶劑中，N-保護(hù)氨基酸能與DCC很快地反應(yīng)生成對(duì)稱(chēng)酸酐。因此只要反應(yīng)物能夠溶解，應(yīng)盡可能選用低介電常數(shù)的溶劑。在固相合成中,絕大多數(shù)都是采用DCM為溶劑，它比選用DMF為反應(yīng)溶劑有消旋率小和N-?；逍纬奢^慢兩點(diǎn)好處。在遇到羧基組分不易溶解時(shí),可加數(shù)滴重蒸DMF助溶。合生生物-專(zhuān)業(yè)多肽合成十余年

四 、縮合試劑主要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）

碳二亞胺型

主要包括：DCC，DIC，EDC.HCl等。采用DCC進(jìn)行反應(yīng)，由于反應(yīng)中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，產(chǎn)生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其價(jià)格便宜，在液相合成中，可以通過(guò)過(guò)濾除去，應(yīng)用仍然相當(dāng)廣泛。EDC.HCl因?yàn)槠渌芙庑缘奶攸c(diǎn)，在多肽與蛋白的連接中使用比較多，而且也相當(dāng)成功。但是該類(lèi)型的縮合試劑的一個(gè)*大的缺點(diǎn)，就是如果單獨(dú)使用，會(huì)有比較多的副反應(yīng)，但是研究表明如果在活化過(guò)程中添加HOBt，HOAt等試劑，可以將其副反應(yīng)控制在很低的范圍。

鎓鹽型

鎓鹽型縮合試劑反應(yīng)活性高，速度快，現(xiàn)在使用非常廣泛，主要包括：HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。該試劑使用過(guò)程中需要添加有機(jī)堿，如，二異丙基乙胺（DIEA），N-甲基嗎啉（NMM），該試劑加入后，才能活化氨基酸。

五 固相合成過(guò)程

1、羥基樹(shù)脂為載體的合成方法（Wang樹(shù)脂為例：圖1）

Wang樹(shù)脂、HMPA樹(shù)脂、Sasrin樹(shù)脂等均在Linker結(jié)構(gòu)中含有芐醇基。多數(shù)情況下把預(yù)制的N一保護(hù)氨基酸的對(duì)稱(chēng)酸酐及催化劑DMAP(對(duì)二甲氨基吡啶)與羥基樹(shù)脂一起反應(yīng)。在這種成鍵反應(yīng)中。DMAP是必需的，但也由此帶來(lái)一些麻煩。例如當(dāng)某些位阻較大、反應(yīng)活性較低的Fmoc-氨基酸需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，而且DMAP的純度又不理想時(shí)。會(huì)發(fā)生部分Fmoc基被脫除，生成部分二肽的麻煩。更常見(jiàn)的危險(xiǎn)是當(dāng)Cys及His作為C端**個(gè)氨基酸與羥基樹(shù)脂反應(yīng)時(shí)，DMAP往往使這兩種氨基酸發(fā)生消旋化。對(duì)此，解決辦法是改用Cl-Trt樹(shù)脂與這兩種氨基酸鍵合，同樣可以生成酯型Linker。另一種解決辦法是用MSNT試劑，可以有效地免除Cys, His與多種羥基樹(shù)脂鍵合時(shí)的消旋化危險(xiǎn)。

2、以三苯甲基樹(shù)脂樹(shù)脂為載體的合成方法

三苯甲基(trt)樹(shù)脂含有三重芐基結(jié)構(gòu)，因此反應(yīng)活性極高。一般用等摩爾量的保護(hù)氨基酸及4倍量的DIEA與Trt樹(shù)脂混在二氯甲烷中，室溫反應(yīng)30-12Omin即達(dá)完全。對(duì)于未反應(yīng)完全的位點(diǎn)，可用甲醇封住位點(diǎn)?；赥rt Linker的溫和鍵合及溫和裂解特點(diǎn)，在此種樹(shù)脂上進(jìn)行膚片段縮合及全保護(hù)基膚片段制備是較理想的方式。

FMOC固相合成Glu-Trp

3、以氨基樹(shù)脂為載體的合成方法

MBHA樹(shù)脂、AM樹(shù)脂、Knorr樹(shù)脂、Rink-NH2樹(shù)脂等均在Linker中含有可與羧酸反應(yīng)的氨基。C端**個(gè)氨基酸與之鍵合的反應(yīng)條件與接肽循環(huán)中的操作完全相同。如果以DCC為縮合劑，一般先將N-保護(hù)氨基酸與DCC、HOBT混于溶劑(DMF、THF、DCM等)中，生成氨基酸的HOBT活潑酯，放置3-5h，待活化反應(yīng)基本完全后濾除副產(chǎn)物DCU沉淀，把羧基活化組分溶液與氨基樹(shù)脂混合進(jìn)行鍵合反應(yīng)。此步反應(yīng)有兩點(diǎn)事項(xiàng)值得注意：①多數(shù)氨基樹(shù)脂的氨基并非以游離狀態(tài)出售。有的氨基是以鹽酸鹽的形式，有的則帶有臨時(shí)保護(hù)基(如Fmoc , Boc等），因此在與C端**個(gè)氨基酸鍵合之前必須進(jìn)行相應(yīng)的中和或脫除臨時(shí)保護(hù)基的處理；②氨基酸活化組分的用量應(yīng)大大高于氨基樹(shù)脂組分，一般的摩爾比為（2-5）：1，目的是使鍵合反應(yīng)接近100% ,因?yàn)槲幢货；陌被鶚?shù)脂無(wú)法從產(chǎn)物中清除出去。使用大大過(guò)量的構(gòu)件是所有固相有機(jī)合成的共同之處。

除了DCC之外，其他常見(jiàn)的縮合劑還有DIC、EDC、EEDQ、HBTU等。

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