PART 01

引言

多肽是由多個(gè)氨基酸（2≤N≤50）通過酰胺鍵連接形成的一類化合物，其分子大小介于小分子化藥和大分子生物藥之間。與小分子化藥相比，多肽具有更高的功效、選擇性和特異性以及更低的代謝毒性；與大分子生物藥比，多肽具有更低的免疫原性，能更深入的滲透到目標(biāo)組織，且連續(xù)生產(chǎn)成本更低?；谶@些獨(dú)特的優(yōu)勢，近年來，多肽類藥物越來越受到關(guān)注，據(jù)統(tǒng)計(jì)，肽藥物市場的增長速度是其他藥物的兩倍，目前已有上千種肽類藥物進(jìn)入市場，用于治療糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、癌癥、多發(fā)性硬化癥、慢性疼痛、HIV感染等多種疾病。在多肽藥物興起的初期，由于多肽藥物的特殊性，針對多肽藥物的指導(dǎo)原則并不多，且對多肽性質(zhì)的了解也不夠深入。隨著多肽藥物數(shù)量的增加和對多肽性質(zhì)理解的不斷加深，針對多肽的指導(dǎo)原則也在不斷地更新和擴(kuò)充，美國和歐洲藥典中均有多個(gè)關(guān)于合成多肽原料藥質(zhì)量控制的相關(guān)章節(jié)，2022年9月EMA發(fā)布了“關(guān)于制定合成肽和合成寡核苷酸研發(fā)生產(chǎn)指南”的概念文件，我國SFDA也于今年更新了《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，這些指導(dǎo)原則為我們進(jìn)行多肽類藥物研發(fā)提供了重要的參考和指引。我們知道，活性肽是產(chǎn)生藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此在肽藥物的開發(fā)過程中，對活性肽（API）進(jìn)行質(zhì)量控制是十分重要的，而肽相關(guān)雜質(zhì)的控制又是質(zhì)量控制的重要工作，雜質(zhì)不僅影響用于臨床試驗(yàn)樣品的質(zhì)量和**性，在藥物發(fā)現(xiàn)的早期階段，這些雜質(zhì)還可能影響藥效的判斷，雜質(zhì)研究不到位甚至可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論。由于在國內(nèi)外批準(zhǔn)的治療肽藥物中合成多肽占多數(shù)（大于70%），因此今天主要探討的是合成多肽的相關(guān)雜質(zhì)以及可能的產(chǎn)生途徑，以期對包裝、儲(chǔ)存條件選擇及制劑**開發(fā)提供一定的指導(dǎo)。

PART 02

雜質(zhì)分類及產(chǎn)生途徑

2.1 合成過程相關(guān)雜質(zhì)

化學(xué)合成技術(shù)是多肽生產(chǎn)的金標(biāo)準(zhǔn)，該工藝*初在溶液中進(jìn)行，后來引入了固相肽合成，固相肽合成一經(jīng)問世就受到研發(fā)者的偏愛，幾十年來不斷發(fā)展與成熟，已穩(wěn)坐化學(xué)合成的**把交椅?；瘜W(xué)合成多肽的步驟包括：掛樹脂-去保護(hù)基-活化和交聯(lián)-肽切割。在這個(gè)過程中去保護(hù)基和活化與交聯(lián)的步驟容易產(chǎn)生雜質(zhì)，通常是需要質(zhì)控的點(diǎn)。

圖1 固相合成流程簡圖及相關(guān)雜質(zhì)的產(chǎn)生途徑

1

缺失肽

顧名思義，缺失肽即是缺失一個(gè)或多個(gè)所需氨基酸的多肽，不完全去除氨基酸的瞬時(shí)保護(hù)集團(tuán)、即將結(jié)合的氨基酸活化不足或交聯(lián)效率低都會(huì)導(dǎo)致缺失肽的產(chǎn)生。缺失肽的鑒定方法，即質(zhì)譜中觀察到的雜質(zhì)與目標(biāo)肽之間的質(zhì)量差為所缺失氨基酸分子量減去水。例如，某合成多肽藥物A目標(biāo)分子量為1311.5，在樣品中檢測出分子量1103.5的雜質(zhì)，與母肽分子量相差208，初步推測至少缺失2個(gè)氨基酸，經(jīng)過推算當(dāng)缺失脯氨酸（分子量：115）及5-氧代脯氨酸（分子量：129）時(shí)所得雜質(zhì)分子量=1311.5-115+18-129+18=1103.5，與所檢測到的該雜質(zhì)質(zhì)荷比相符合。

圖2 某合成多肽藥物A的質(zhì)譜圖

圖3 某合成多肽藥物A缺失肽的質(zhì)譜圖

2

插入肽

在合成多肽交聯(lián)過程中通常會(huì)將氨基酸過量投料，如果過量的氨基酸未被充分洗滌或者反應(yīng)時(shí)間過長會(huì)將氨基酸再次交聯(lián)，產(chǎn)生插入肽。對于插入肽的鑒定方法，即質(zhì)譜中觀察到的雜質(zhì)與目標(biāo)肽之間的質(zhì)量差為所插入氨基酸分子量減去水。例如：上述某合成多肽藥物A目標(biāo)分子量為1311.5，在樣品中檢測出分子量1474.9的雜質(zhì)，與母肽分子量相差163.4，初步推測插入酪氨酸，酪氨酸分子量為181，雜質(zhì)分子量=1311.5+181-18=1474.5，與所檢測到的該雜質(zhì)質(zhì)荷比相符合。

圖4 某合成多肽藥物A插入肽的質(zhì)譜圖

3

錯(cuò)結(jié)肽

當(dāng)固相反應(yīng)過程中既發(fā)生氨基酸缺失又發(fā)生氨基酸插入時(shí)就會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)結(jié)肽。

4

共價(jià)附著肽雜質(zhì)

在固相合成完成后長久性保護(hù)基團(tuán)不完全去除將導(dǎo)致保護(hù)基共價(jià)附著在肽序列中，產(chǎn)生共價(jià)附著肽雜質(zhì)。對于這類雜質(zhì)的鑒定方法，如果質(zhì)譜中雜質(zhì)分子量與目標(biāo)肽分子量相差56 Da，那么附著的保護(hù)基為tBu保護(hù)基，如果質(zhì)譜中雜質(zhì)分子量與目標(biāo)肽分子量相差100 Da，那么附著的保護(hù)基為tBoc-TCS保護(hù)基。

2.2 降解相關(guān)雜質(zhì)

降解相關(guān)雜質(zhì)包括制造過程中通過降解機(jī)制形成的雜質(zhì)和儲(chǔ)存過程中通過降解機(jī)制形成的雜質(zhì)。引起多肽不穩(wěn)定的因素包括氧化、光照、高溫、pH、離子強(qiáng)度變化及吸附等，肽鏈中氨基酸種類及氨基酸所在的位置對多肽的穩(wěn)定性有重要影響。因穩(wěn)定性而產(chǎn)生的肽雜質(zhì)包括：

1

差向肽

差向肽是指序列中含有1個(gè)或多個(gè)非預(yù)期手性構(gòu)型的氨基酸殘基所形成的雜質(zhì)，其產(chǎn)生可能源于起始物料中的光學(xué)異構(gòu)體，也可能是合成過程中氨基酸手性中心烯醇化或氮雜內(nèi)酯化形成。差向肽雜質(zhì)的色譜行為與主成分非常接近，分子量也與主成分一樣，僅此分離和鑒定難度較大?？刹捎秒噭Χ嚯倪M(jìn)行水解并衍生化處理，通過水解所得氨基酸的手性異構(gòu)體的含量判斷肽鏈中易發(fā)生消旋的氨基酸，通過定向制備可能的差向異構(gòu)體肽進(jìn)行有針對性的研究。

圖5 差向肽形成機(jī)制（A）烯醇化（B）氮雜內(nèi)脂化

2

缺失肽（斷裂肽）

此處的缺失肽與合成過程中的缺失肽不同，此處主要是指斷裂肽。多肽化合物在遇到高溫或pH變化時(shí)可能發(fā)生肽鍵斷裂，產(chǎn)生斷裂肽，有研究表明堿性條件*易引起肽鍵斷裂。斷裂肽的鑒定相對簡單，通過雜質(zhì)與母肽的分子量差可以推斷是哪個(gè)酰胺鍵斷裂。

3

脫酰胺雜質(zhì)

當(dāng)多肽中含有谷氨酰胺或天冬酰胺殘基時(shí)，可能脫去酰胺鍵形成谷氨酸或天冬氨酸殘基，形成的機(jī)制有兩種，一是直接水解（pH<5時(shí)容易發(fā)生），二是通過β轉(zhuǎn)變（堿性條件下易發(fā)生），β轉(zhuǎn)變通過主鏈中酰胺鍵的N原子攻擊側(cè)鏈上的羰基，形成琥珀酰亞胺環(huán)（氮雜內(nèi)酯的一種），在堿性或中性條件下水解形成羧基。琥珀酰亞胺水解過程往往還伴隨著兩個(gè)副反應(yīng)即異構(gòu)化和外消旋化，*終形成4個(gè)分子量相同的異構(gòu)體產(chǎn)物。脫酰胺雜質(zhì)的鑒定主要通過質(zhì)譜，檢測到分子量+1 Da的雜質(zhì)通常是脫酰胺雜質(zhì)。

圖6天冬酰胺脫酰胺雜質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制

4

異構(gòu)化雜質(zhì)

天冬氨酸是容易產(chǎn)生異構(gòu)化的氨基酸，天冬氨酸容易因側(cè)鏈?zhǔn)虬倍h(huán)化到主鏈，形成琥珀酰亞胺，琥珀酰亞胺穩(wěn)定性較差，易水解開環(huán)，在開環(huán)的過程可形成異構(gòu)體，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生差向肽副產(chǎn)物，其生成機(jī)制與天冬酰胺脫酰胺相似。

圖7天冬氨酸相關(guān)雜質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制

二嗪哌酮是指N端活性基團(tuán)（通常為氨基）進(jìn)攻β位主鏈酰胺鍵的羰基，形成二酮哌嗪類似物，得到缺失兩個(gè)氨基酸的缺失肽，當(dāng)N端氨基酸位阻較小時(shí)反應(yīng)更容易發(fā)生。

圖8 二嗪哌酮雜質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制

焦谷氨酸是指N-端含有的谷氨酸發(fā)生環(huán)化形成吡咯烷酮羧酸。該雜質(zhì)的鑒定可采用質(zhì)譜，分子量較母肽減少17Da（脫去NH3）。

圖9 焦谷氨酸相關(guān)雜質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制

6

聚合物

多肽分子間聚集和自結(jié)合可導(dǎo)致高分子量雜質(zhì)也就是聚合物的形成。聚合機(jī)制有共價(jià)和非共價(jià)兩種，非共價(jià)聚合通過靜電或疏水相互作用形成，是一種中間狀態(tài)，當(dāng)溶液濃度、pH或離子強(qiáng)度發(fā)生變化時(shí)，這種作用力容易減弱或消失，聚合狀態(tài)恢復(fù)到單體狀態(tài)；當(dāng)肽鏈中含有巰基或酪氨酸時(shí)可通過生成二硫鍵或形成二酪氨酸而引起共價(jià)聚合，共價(jià)聚合是一種穩(wěn)定的聚合狀態(tài)，不會(huì)隨肽濃度或pH、離子強(qiáng)度等而改變聚合狀態(tài)。聚合物雜質(zhì)由于其分子量和體積的進(jìn)一步加大，容易增加免疫原性，引起過敏性反應(yīng)，因此應(yīng)合理控制聚合物的含量。聚合物的檢測通常采用體積排阻色譜，與質(zhì)譜聯(lián)用后可以判斷其聚合體的倍數(shù)。

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氧化雜質(zhì)

氧化雜質(zhì)是多肽在儲(chǔ)存過程中接觸氧氣和光的情況下形成的，易發(fā)生氧化的氨基酸包括含硫氨基酸、組氨酸、酪氨酸、色氨酸。①含有硫的氨基酸（甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸）容易發(fā)生氧化反應(yīng)，氧化途徑有兩種，一是生成二硫鍵，雜質(zhì)分子量為母肽分子量2倍減2，二者生成亞砜、砜和磺酸，雜質(zhì)分子量與母肽的分子量通常相差16Da、32Da或48Da（圖10 A、B）。②酪氨酸中酚羥基及臨位均可成為氧化位點(diǎn)，氧化會(huì)生成2-氨基-3-(3,4-二氧環(huán)己-1,5-二烯基)丙酸，分子量增加14（圖10 C）。③組氨酸氧化有兩種途徑，一是咪唑環(huán)的雙鍵氧化成羰基，其氧化雜質(zhì)與母肽分子量相差16Da，另一種氧化途徑是生成n -甲?；虬彼幔肿恿肯嗖?8（圖10 D）。④色氨酸在氧化條件下可生成羥色氨酸（分子量增加16Da）或犬色氨酸（分子量增加4Da），犬色氨酸進(jìn)一步氧化可生成羥基-甲酰犬尿氨酸（分子量增加48Da）（圖10 E）。

圖10 多肽氧化的降解機(jī)制

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其他雜質(zhì)

多肽除發(fā)生以上降解外還會(huì)在還原劑存在的條件下發(fā)生還原反應(yīng)，如二硫鍵還原為巰基，這一反應(yīng)與相應(yīng)的氧化反應(yīng)形成動(dòng)態(tài)平衡。此外，物理不穩(wěn)定性也是需要關(guān)注的問題，如與包材、濾膜等發(fā)生吸附或當(dāng)多肽分子微環(huán)境發(fā)生變化時(shí)其**結(jié)構(gòu)發(fā)生改變等，這些都可能引起藥效改變或產(chǎn)生**性的風(fēng)險(xiǎn)。PART 03

小結(jié)

多肽的肽相關(guān)雜質(zhì)不僅是藥物開發(fā)和生產(chǎn)過程中GMP監(jiān)管需要持續(xù)關(guān)注的問題，在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的早期階段還可能因?yàn)殡s質(zhì)的拮抗作用或超強(qiáng)的藥效引起研發(fā)者的誤判，因此通常在開展生物試驗(yàn)時(shí)，建議采用不同來源的肽進(jìn)行復(fù)測，以排除雜質(zhì)對藥效的影響。

合成過程相關(guān)的肽雜質(zhì)包括fmoc脫保護(hù)效率低下、氨基酸活化不足或交聯(lián)效率低下、氨基酸過量或反應(yīng)時(shí)間過長引起的缺失肽、插入肽。與穩(wěn)定性相關(guān)的雜質(zhì)包括差向肽、斷裂肽、脫酰胺雜質(zhì)、異構(gòu)化雜質(zhì)、聚合物、二嗪哌酮和焦谷氨酸、氧化等。了解多肽類藥物雜質(zhì)產(chǎn)生的原因，我們不僅可以對容易產(chǎn)生雜質(zhì)的合成步驟進(jìn)行監(jiān)控，在后續(xù)制劑**設(shè)計(jì)和儲(chǔ)存過程中我們也可依據(jù)由于多肽不穩(wěn)定所產(chǎn)生雜質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)制有針對性的設(shè)計(jì)**工藝和儲(chǔ)存條件，確保多肽藥物的質(zhì)量在可接受范圍內(nèi)。